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Zootecnia Tropical

Print version ISSN 0798-7269

Zootecnia Trop. vol.20 no.4 Maracay  2002

 

NOTA TÉCNICA

Determinación de saxitoxina y sus derivados en moluscos bivalvos:Evaluación y optimización del uso de cromatografía líquida de alta resolución con previa oxidación

Luisa Rojas de Astudillo1, Iván Chang-Yen2, Amelia La Barbera-Sánchez3

1Departamento de Química, Escuela de Ciencias, Núcleo de Sucre, Universidad de Oriente. Correo-e: lrojas@sucre.udo.edo.ve 

2Department of Chemistry, University of the West Indies, St Augustine, Trinidad, WI.

3Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA-Sucre/Nva. Esparta).

RESUMEN

La saxitoxina y sus derivados son potentes neurotoxinas que originan afecciones asociadas a la intoxicación paralizante en humanos (PSP, siglas en inglés) que son producidas primariamente por dinoflagelados. Con la finalidad de evaluar y optimizar el uso de la cromatografía líquida de alta resolución con previa oxidación para la determinación de la saxitoxina y sus derivados se tomaron muestras de mejillones verdes (Perna viridis) y ostras (Crassostrea sp) en seis localidades de Venezuela y cuatro de Trinidad, de éste último a lo largo de la costa occidental, durante el mes de junio del 2000. Las muestras fueron extraídas siguiendo el procedimiento AOAC usado para el bioensayo de ratón. Cada extracto fue oxidado usando ácido peryódico y el producto de oxidación inyectado a la columna cromatográfica. El método utilizado para la cromatografía líquida de alta resolución con detector de fluorescencia correspondió a una modificación del sugerido por Lawrence et al. (1996). Se logró la separación de importantes pares de toxinas (STX/NEO, GTX1,4/GTX2,3), pero la resolución y la altura de los picos de los productos de oxidación de esas toxinas variaron dependiendo de la eficiencia de las columnas utilizadas. Algunas muestras presentaron contaminación por PSP, pero las concentraciones estuvieron por debajo de los límites permisibles, las cuales fueron confirmadas por el método de bioensayo del ratón. Los resultados demuestran que el método de reacción precolumna provee una información rápida acerca de la composición de las toxinas, independiente de la matriz del organismo receptor y es un método simplificado para el monitoreo de PSP en moluscos en el Caribe.

Palabras clave: Saxitoxina, PSP, neurotoxina, dinoflagelados, tóxicos.

Determination of saxitoxin and its derivatives in mollusk bivalves: Evaluation and optimization of the high performance liquid chromatographic use with fluorescence detection and prior oxidation.

SUMMARY

Saxitoxin and its derivatives are potent neurotoxins associated with paralytic shellfish poisoning (PSP) in humans which are primarily produced by dinoflagellates. To evaluate and optimize the use of high performance liquid chromatography (HPLC) with previous oxidation in order to determine saxitoxin and its derivatives, samples of the green mussel (Perna viridis) and oysters (Crassostrea sp) were collected at six locations in Venezuela and at four in Trinidad, the latter along the west coast line, in June 2000. The samples were extracted using the AOAC bioassay mouse procedure. Each extract was oxidized using periodic acid and the oxidation product was injected to the chromatographic column. The method used to HPLC in this work was a modification of Lawrence et al. (1996). The separation of important pairs of toxins (STX/NEO, GTX1,4/GTX2,3) were achieved, but the resolution and height of the peaks of oxidation products of these toxins varied depending on column efficiencies. Some samples had presence of PSP below permissible levels, which was confirmed by using bioassay mouse method. The results showed that the reaction precolumn method gives prompt information about profile of the toxins, which is independent of matrix of receptor organism, and it is a simple method for monitoring PSP in shellfish in the Caribbean.

Key words: saxitoxin, PSP, neurotoxin, dinoflagellate, toxic.

Recibido:08/05/02   Aceptado: 25/10/02

INTRODUCCION

La acumulación de toxinas por moluscos como un resultado de la ingesta de dinoflagelados tóxicos ha sido un gran riesgo para la salud pública y ha causado grandes pérdidas a la industria de productos marinos. La más conocida de todas las intoxicaciones es la intoxicación paralizante por consumo de mariscos (PSP, siglas en inglés) causada por neurotoxinas que son producidas primariamente por varias especies de dinoflagelados. Eventos de PSP causados por dinoflagelados han sido registrados en Venezuela desde hace 25 años y en Trinidad recientemente (Chang-Yen et al., 1999; Ammons et al., 2001; La Barbera-Sánchez y Estrella, 1996). Colectivamente esas toxinas PSP son denominadas saxitoxinas derivando su nombre del Saxidomus giganteus, en donde la saxitoxina fue originalmente extraída e identificada (Bates y Rapoport, 1975).

 Saxitoxina es el primer compuesto marino cuyo origen se asoció al fitoplancton (Shimizu, 1993). Existen aproximadamente 21 formas moleculares de esas toxinas (Figura 1) que han sido aisladas de dinoflagelados tales como Alexandrium spp., Gymnodinium catenatum, y Pyrodinium bahamense var. compressum (Yasumoto et al., 1995). Todas las saxitoxinas bloquean el movimiento del ión sodio a través de la membrana celular nerviosa, paralizando el flujo del impulso nervioso que causan los síntomas de PSP (Mosher et al., 1964).

R1

  R2

 R3

   NR4: -OOCNH2

     R4: -OOCNHSO3-

 R4:  OH

  R4: H 

  H

  H

  H

STX

GTX5 (B1)

 DcSTX

 DoSTX

OH

  H

  H

NeoSTX

GTX6 (B2) 

DcneoSTX

     -

OH

OSO3-

  H

GTX1

C3

DcGTX1

     -

  H

OSO3-

  H

GTX2

C1

DcGTX2

DoGTX1

  H

  H

OSO3-

GTX3 

C2

DcGTX3

DoGTX2

OH

  H

OSO3-

GTX4

C4

DcGTX4

      -

STX: Saxitoxina; GTX: Gonyautoxina; dc: decarbamoyl; do:deoxycarbamoyl

Figura 1. Estructuras (I) y productos de la reacción de oxidación (II) de las toxinas PSP.

Saxitoxinas y sus espontáneas transformaciones son el principal factor de impedimento para el desarrollo de una simple prueba de campo para medir toxinas (Sullivan y Wekell, 1988).

El bioensayo de ratón, método aprobado por la Oficina de Administración de Alimentos y Drogas de los Estados Unidos (FDA, siglas en inglés) como un procedimiento para detectar y cuantificar toxinas en moluscos, mide simultáneamente todas las toxicidades del total de saxitoxinas a partir de una muestra de tejido del molusco. Sin embargo, este método es debil para detectar eficientemente análogos de saxitoxinas de bajas toxicidades (toxinas B y C, Figura 1) (Casais Laiño, 1991). 

 Además del método de bioensayo del ratón, otros métodos químicos como ensayos inmunoenzimáticos o ELISA (Chu y Fan, 1985), y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) han sido usados para determinar toxinas PSP (Oshima 1995; Lawrence et al., 1996). Sin embargo, el método más efectivo para confirmar toxicidad y determinar el perfil de la toxina del organismo afectado es la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (Sullivan,1985). Debido a la naturaleza química de las toxinas PSP, las cuales son altamente polares y carecen de un cromóforo sensitivo a la absorción de luz ultravioleta, la técnica más común utilizada en HPLC consiste en obtener un compuesto fluorescente, a través de una reacción de oxidación, la cual es detectada y cuantificada por fluorometría (Sullivan et al., 1985; Oshima et al., 1996; Lawrence et al., 1996). En este estudio, se planteó como objetivo, demostrar que el método HPLC con reacción precolumna provee información veraz y oportuna de la composición química de la saxitoxina y sus derivados.

MATERIALES Y METODOS

1.Muestras

Muestras de mejillones (Perna viridis) y ostras (Crassostrea rhizophorae y C. virginica) se recolectaron en bancos naturales en seis localidades de Venezuela ubicadas en los estados Sucre y Nueva Esparta y cuatro a lo largo de la costa occidental de Trinidad (Cuadro 1 y Figura 2). El muestreo se realizó en junio de 2000. Todo el tejido de las muestras fue extraído y almacenado congelado hasta su análisis. La identificación de las diferentes especies de ostras y mejillones fue efectuada en el Departamento de Biología de la Universidad de Oriente (Prof. Antulio Prieto) y con un catálogo de moluscos marinos de las costas de Venezuela (Lodeiros et al., 1999).

Cuadro 1. Especies colectadas durante el muestreo en cada localidad de TrinidadyVenezuela.

País

Localidad

Especie

Perna viridis

Crassostrea rizophorae

Crassostrea. virginica

Venezuela 

La Restinga, Isla de Margarita

X

X

Chacopata

X

Río Caribe

X

Guiria

X

X

Yaguaraparo

X

Pedernales

X

Trinidad

Chaguaramas

X

X

Caroni

X

X

La Brea

X

X

Cedros

X

X

Figura 2. Localidades de muestreo en Trinidad y Venezuela

2.Preparación de las muestras para el HPLC

  Las muestras de ostras (Crassostrea rhizophorae y crassostrea virginica) y mejillones (Perna viridis) se extrajeron de acuerdo al procedimiento usado para el bioensayo de ratón (A.O.A.C, 1990). Cien gramos de tejido licuado y homogenizado fueron hervidos con 100 ml de 0,1 mol/l HCl. Después de hervir por 5 minutos y enfriado, el pH fue ajustado aproximadamente a un valor de 3 con NaOH (1mol/l) y el extracto se centrifugó a 4000 rpm por 12 min. El líquido sobrenadante se decantó cuidadosamente en un envase plástico y se almacenó a –4°C hasta que el análisis se realizó. Previo al análisis, un procedimiento de extracción de fase sólida en microcolumnas (500 mg/3 ml de volumen) fue aplicado para limpiar las muestras. La sílica gel fue derivada con modificaciones del procedimiento sugerido por Knapp (1979). Cada microcolumna usada se acondicionó con 6 ml de etanol, seguido de 6 ml de agua. A cada microcolumna se le agrego 1 ml de extracto y el efluente se recolectó en un vial (5,0 x 1,8 cm de diámetro) limpio y prepesado. La microcolumna fue eluida con 2 ml de agua y el efluente combinado en el vial. El vial fue repesado y se le adicionó agua desionizada hasta obtener una masa del extracto de 4 g. Las alícuotas de cada extracto fueron usadas para la reacción de oxidación con ácido peryódico, previo al análisis con el HPLC.

3. Reacción de oxidación 

El reactivo para la oxidación de las muestras se preparó diariamente de acuerdo a lo recomendado por Lawrence et al. (1996), mezclando 5 ml de 0,03 mol/l de ácido peryódico, 0,3 mol/l de formato de amonio y 0,3 M de Na2HPO4. Se ajusto el pH a 8,2 usando 0,2 mol/l de NaOH. En un vial de 1,5 ml, se preparó una mezcla de 100 ml de extracto de molusco o de estándar y de 500 ml del reactivo oxidante con un mezclador vortex. La solución se dejó reaccionar a temperatura ambiente por 1 minuto, se le agrego 5 ml de ácido acético glacial y se mezcló para estabilizar el producto de la reacción. La mezcla se dejo en reposo por 10 minutos adicionales a temperatura ambiente antes de ser inyectada al sistema cromatográfico.

4.  Análisis cromatográfico

El sistema de cromatografía líquida consistió de una bomba de gradientes (LKB Model 2249) un puerto de inyección (Rheodyne, Model 2494) para 20 ml de muestra. Se usaron cuatro columnas de fase reversa y C18 de diferentes casas comerciales. Un espectrofotómetro de luminiscencia (Perkin Elmer, Model LS50B) fijado a 330 nm (excitación) y 400 nm (emisión), ajustado a una celda de flujo para cromatografía líquida de alta resolución, fue usado para monitorear el efluente de la cromatografía líquida. Se usó una fase móvil por gradiente de acuerdo a Lawrence et al. (1996), esto es: 0-1% acetonitrilo los primeros 15 minutos y 1- 4% los 7 minutos restantes. Las concentraciones de las toxinas se determinaron por comparación del área del pico de cada toxina con los de los patrones calibrados.

Las soluciones certificadas de calibración que contienen STX, NEOSTX, GTX1,4, GTX2,3 utilizadas para preparar la curva de calibración fueron obtenidas del National Research Council of Canada.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Con el método de cromatografía líquida de alta resolución con detección de fluorescencia y reacción previa se conformó la detección de saxitoxinas por su espectro de absorción y emisión (Figura 3). La saxitoxina presentó el mismo tiempo de retención en su cromatograma, como toxina individual y en una mezcla con GTX1,4, NeoSTX, GTX2,3 (Figura 4), lográndose la separación de importantes pares de toxinas (STX/NEO, GTX1,4/GTX2,3), pero la resolución y la altura de los picos de los productos de oxidación de esas toxinas variaron dependiendo de la eficiencia de las columnas utilizadas. Con reacción precolumna es difícil separar los epímeros GTX1 de GTX4 y GTX2 de GTX3. 

Figura 3. Espectros de absorción (A) y de emisión (B) de satitoxina.

Figura 4. Cromatograma de una mezcla de toxinas PSP (GTX1.4; NeoSTX; GTX 2.3; STX)

El orden de elusión de las toxinas en los cromatogramas obtenidos estuvieron en concordancia con lo planteado por Lawrence et al. (1995). El rendimiento fue de 85-104% por adicionar concentraciones conocidas de toxinas a muestras no contaminadas. El límite de detección fue de 10 mg PSP/100 g de tejido de molusco comparado con 40 mg PSP/100 g obtenido por el bioensayo con ratones. Con respecto a las muestras analizadas, solamente gonyaulatoxina GTX2,3 fue detectada en muestras de Chaguaramas (Perna viridis), Trinidad, Guiria (C. virginica), Río Caribe (Perna viridis) y Yaguaraparo (C. virginica), estado Sucre, Venezuela (Cuadro 1, Figura 2); en concentraciones que estuvieron por debajo de los límites permisibles (<80 mg/100 g tejido fresco). La baja toxicidad de las muestras fue confirmada por la técnica de bioensayo del ratón, en la cual, los ratones sólo presentaron algunos síntomas asociados a PSP, pero no murieron. Esto impidió calcular con exactitud la toxicidad real de la muestra.

 Los valores de toxinas PSP encontrados fueron bajos; sin embargo, su presencia indica un riesgo potencial para los humanos, por lo que es necesario implementar el desarrollo de estudios en áreas de crecimiento de moluscos bivalvos que permitan proteger la salud pública. 

CONCLUSIONES

Los resultados demuestran que el método de reacción precolumna provee una información rápida acerca de la composición de las toxinas, independiente de la matriz del organismo receptor. Además, resulta un método simplificado para el monitoreo de toxinas PSP en moluscos del Caribe, zona que incluye a Trinidad y a Venezuela y en la cual las células de algas tóxicas son movilizadas, concentradas o dispersadas por los vientos, mareas y corrientes marinas, y donde probablemente los moluscos filtradores llegan a ser más tóxicos que en las áreas con concentraciones más altas de estas algas.

RECOMENDACIONES

Continuos estudios son necesarios para mejorar la identificación y cuantificación de los diferentes derivados fluorescentes usando el método de cromatografía líquida de alta resolución, que logren separar aquellos pares de toxinas, tales como: GTX1 de GTX4 y GTX2 de GTX3, hasta ahora no logrado con el método de oxidación previa.

AGRADECIMIENTOS

El financiamiento para realizar esta investigación fue aportado por el por el Consejo de Investigación de la Universidad de Oriente, The University of the West Indies y por el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICIT). Se agradece la colaboración prestada por la Embajada de Venezuela en Trinidad, la Guardia Nacional de Venezuela, el Instituto de Investigaciones Biomédicas (IIBCA), el Instituto Oceanográfico de Venezuela, y el Instituto de Estudios del Mar de la UDO.

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